PROJETO GENOMA HUMANO: CONHEÇA A FERRAMENTA DE SEQUENCIAMENTO DE DNA UTILIZADO E NOVAS TECNOLOGIAS
Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular. Os estudos surgiram com o objetivo de conhecer o funcionamento de uma célula ou organismo, além de conhecer possíveis doenças e tentar encontrar a cura. Para que isto fosse possível, foram descobertos várias técnicas, entre elas o sequenciamento genético, afim de descobrir a sequência das bases nitrogenadas do DNA.
1.O QUE É O SEQUENCIMENTO DE DNA ?
Atualmente tem sido ouvido muito falar que genomas estão sendo sequenciados e o exemplo clássico é o Projeto Genoma Humano que foi concluído em 2003. E falar sobre o sequenciamento de DNA significa dizer que é o processo de determinação da sequência de bases nucleotídicas (As, Ts, Cs e Gs,) em um pedaço de DNA. Hoje em dia, com os materiais e equipamentos corretos, sequenciar um pequeno fragmento de DNA é relativamente simples.
Sequenciar um genoma inteiro (todo o DNA de um organismo) demonstra ser uma tarefa complexa, ou seja, isto requer quebrar o DNA do genoma em pequenos fragmentos, sequenciar esses pedaços e montar as sequências em uma única e longa sequência “consenso”. Entretanto, graças aos novos métodos que tem sido desenvolvidos nas duas últimas décadas, o sequenciamento genômico é agora muito mais rápido e mais barato do que era durante o Projeto Genoma Humano.
Neste artigo, nós veremos os métodos usados para sequenciamento de DNA. Focaremos no método já bem estabelecido, método Sanger de sequenciamento, mas também discutiremos os novos métodos ("nova geração") que tem reduzido custos e acelerado a velocidade de sequenciamentos em larga escala.
2.COMO FUNCIONA E OS SEUS MÉTODOS ?
MÉTODO QUIMICO OU MAXAM - GILBERT
O primeiro método de sequenciamento de DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou conhecido como método químico ou Maxam – Gilbert, método no qual foi amplamente aplicável na época, pouco usado.
MÉTODO DE SEQUENCIAMENTO DE SANGER
Alguns anos depois, em 1977, Frederick Sanger propõe um método diferente e mais eficiente chamado de método enzimático ou de Sanger. Esse método logo se tornou altamente replicável e é utilizado até os dias de hoje. A partir daí, sequencias com até 96% de similaridade puderam ser diferenciadas ou seja, com até 900 pares de base de comprimento foram rotineiramente sequenciados.
No Projeto Genoma Humano, o método Sanger foi usado para determinar as sequencias de muitos fragmentos relativamente pequenos de DNA humano. (Esses fragmentos não tinham necessariamente 900pb ou menos, mas os pesquisadores conseguiam "caminhar" ao longo de cada fragmento usando diversas rodadas de sequenciamento por Sanger.) Os fragmentos foram alinhados com base nas porções de sobreposição compondo sequencias de regiões mais longas de DNA e, eventualmente, os cromossomos inteiros.
Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados usando outros métodos mais rápidos e baratos, o método Sanger ainda é amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de DNA ou gerados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
INGREDIENTES PARA O SEQUENCIAMENTO DE SANGER
Os ingredientes são similares àqueles usados para replicação de DNA em um organismo, ou para a reação em cadeia da polimerase (PCR), os quais fazem cópias de DNA in vitro. Eles incluem:
Uma enzima DNA polimerase
Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase
Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
O DNA molde a ser sequenciado
USOS E LIMITAÇÕES DO MÉTODO DE SANGER
O método Sanger de sequenciamento promove sequências de alta qualidade para trechos relativamente longos (por volta de 900 pares de base). É tipicamente usado para sequenciar peças individuais de DNA, como plasmídeos bacterianos ou DNA copiado em PCR.
Entretanto, o método Sanger de sequenciamento é caro e ineficiente para projetos de larga escala, como o sequenciamento de um genoma inteiro ou metagenoma (o "genoma coletivo" de uma comunidade microbiana). Para tarefas como essa, novas técnicas de sequenciamento de larga escala são mais rápidas e menos caras.
SEQUENCIAMENTO DA NOVA GERAÇÃO
O mais recente conjunto de tecnologias de sequenciamento de DNA é coletivamente chamado de sequenciamento da nova geração.
Existe uma variedade de técnicas de sequenciamento de nova geração que usam diferentes tecnologias. No entanto, a maioria tem algumas características em comum que as distinguem do sequenciamento Sanger:
Alto paralelismo: muitas reações de sequenciamento ocorrem ao mesmo tempo
Microescala: reações são pequenas e muitas podem ser realizadas de uma vez em um chip
Rapidez: pelas reações serem feitas em paralelo, resultados são obtidos muito mais rápido
Baixo custo: sequenciar um genoma é mais barato do que com o sequenciamento Sanger
Menor comprimento: leituras tipicamente variam entre 50 - 700 nucleotídeos de comprimento
Conceitualmente, o sequenciamento de nova geração é algo como conduzir um grande número de pequenas reações Sanger de sequenciamento em paralelo. Graças a essa paralelização e pequena escala, grandes quantidades de DNA podem ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com métodos de próxima geração do que com sequenciamento Sanger. Por exemplo, em 2001, o custo de sequenciar o genoma humano era quase 100 milhões de dólares. Em 2015, era apenas 1,245 dólares
3.PORQUE UM SEQUENCIAMENTO RÁPIDO E BARATO IMPORTA?
A habilidade de sequenciar genomas rotineiramente abre novas possibilidades para pesquisas em biologia e aplicações biomédicas. Por exemplo, sequenciamento de baixo custo é um passo em direção à medicina personalizada – isso é, tratamento médico adaptado às necessidades de um indivíduo, baseado nas variante gênicas no seu genoma.
